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自FDA 1986年批準(zhǔn)第一個(gè)單克隆抗體以來,目前已經(jīng)有超過100多個(gè)抗體被批準(zhǔn)上市,用于治療病毒感染,腫瘤,自身免疫疾病,代謝性疾病,神經(jīng)疾病和器官移植等疾病,特別是在腫瘤治療領(lǐng)域,目前已經(jīng)有多種類型的抗體如scFvs,ADC,雙特異抗體等。從抗體發(fā)現(xiàn)方面來看,這些已經(jīng)批準(zhǔn)的抗體主要來源于以下幾種技術(shù):雜交瘤,噬菌體展示,酵母展示,人源化小鼠,單個(gè)B細(xì)胞技術(shù),但究其本質(zhì),基本上所有抗體最終都是來自于B細(xì)胞(除了一些合成庫),因此如何高效的獲取特異性B細(xì)胞一直以來是抗體發(fā)現(xiàn)前進(jìn)的方向。近日 Cell上發(fā)表了一篇名為Single B cell technologies for monoclonal antibody discovery綜述對單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行了匯總。
文章基于B細(xì)胞的培養(yǎng)方式將這些技術(shù)分為兩大類,共6種:1)傳統(tǒng)的基于孔板(96或者384)或者玻片等大體積培養(yǎng)的技術(shù),如雜交瘤,記憶B細(xì)胞或者ASC(antibody-secreting cells)培養(yǎng)技術(shù)及基于BCR的抗原染色技術(shù);2)在微小體積中培養(yǎng)的技術(shù),如Single B cell screening methodologies,B cell replica methodologies,Single B cell repertoire analysis and clonal expansion-guided identification。
下表匯總了6種技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn),傳統(tǒng)的雜交瘤在費(fèi)用,親和力等方面具有一定優(yōu)勢,但是在耗時(shí),通量及特殊抗體(一些特殊表位的抗體)方面有一定的難度;而一些比較成熟的B細(xì)胞分選技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn),這里不再詳細(xì)介紹。
雜交瘤
B細(xì)胞在體外存活時(shí)間較短,因此為鑒別分泌特定抗體的B細(xì)胞帶來了挑戰(zhàn)。為了延長B細(xì)胞的存活時(shí)間,研究者們開發(fā)了B細(xì)胞永生化技術(shù),如將B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合或者用EBV病毒感染B細(xì)胞。
雜交瘤技術(shù)是我們熟知的一種B細(xì)胞永生化技術(shù),它將能夠分泌抗體的B細(xì)胞ASCs與骨髓瘤細(xì)胞融合,使得ASCs能夠獲得瘤細(xì)胞無限繁殖的優(yōu)勢,并且在生長過程中將抗體分泌于培養(yǎng)傷情以供檢測篩選。最初的雜交瘤是小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤融合,但是后來有研究者相繼開發(fā)了骨髓,淋巴結(jié)和PBMC等組織細(xì)胞的融合技術(shù),并且該技術(shù)也被推廣到了不同種屬如兔子等雜交瘤的制備。融合后利用HAT(次黃嘌呤,氨基碟呤和胸腺嘧啶)培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,排除沒有融合的B細(xì)胞或者骨髓瘤細(xì)胞。為了防止陽性克隆的丟失,一般在融合后的1-2周進(jìn)行抗體特異性檢測,并進(jìn)行亞克隆形成單克隆。
雜交瘤的缺點(diǎn)是,融合的效率相對較低,因此融合后會丟失很多特異性B細(xì)胞。另外,陰性B細(xì)胞形成的雜交瘤會與陽性雜交瘤競爭,可能會導(dǎo)致陽性雜交瘤的丟失。
記憶B細(xì)胞和ASC培養(yǎng)技術(shù)
得益于過去20年B細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展,使得記憶型B細(xì)胞不必進(jìn)行永生化也可以在化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中生長。通過特定方法將B細(xì)胞分選到96或者384孔板進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)后既可以進(jìn)行ELISA篩選也可以進(jìn)行功能性篩選,如中和試驗(yàn)等。該方法可以篩選到一些特殊功能的抗體,如廣譜中和抗體。HIV,SARS-CoV-1的一些廣譜中和抗體就是通過該方法篩選的。
另外,基于該培養(yǎng)方式,還可以通過半固體培養(yǎng)基,利用抗原包被磁珠,搭配熒光標(biāo)記的二抗,篩選能夠分泌目標(biāo)抗體的B細(xì)胞,該方法因?yàn)槔冒牍腆w培養(yǎng)基,因此無需物理上對B細(xì)胞進(jìn)行分離,其篩選基數(shù)會更大。
基于BCR的技術(shù)的篩選
該篩選方法是基于記憶型B細(xì)胞表面的抗體(BCR),其主要是對抗原進(jìn)行標(biāo)記,如熒光標(biāo)記,磁珠標(biāo)記或者是核酸標(biāo)記,然后利用這些標(biāo)記的抗原對目標(biāo)B細(xì)胞進(jìn)行分離,如通過熒光進(jìn)行FACS篩選。該方法在篩選中容易產(chǎn)生假陽性,因此實(shí)際篩選中經(jīng)常對抗原進(jìn)行不同的標(biāo)記,如雙熒光或者不同的Tag標(biāo)簽等,進(jìn)行交叉篩選排除非特異性結(jié)合的B細(xì)胞。
該技術(shù)是目前比較流行的篩選方法,因?yàn)槠渚哂休^高的通量,較低的成本并且簡便易操作。但是由于該方法是基于BCR篩選,因此只能篩選記憶型B細(xì)胞,而沒有BCR的一些B細(xì)胞無法被篩選到。
以上介紹的篩選技術(shù)都是基于常規(guī)的孔板或者微型玻片技術(shù),但是隨著技術(shù)的更新和進(jìn)步,目前出現(xiàn)了多種基于微流控的篩選技術(shù),該技術(shù)使得單個(gè)B細(xì)胞可以在很小體積中培養(yǎng),使得抗體的濃度很快達(dá)到檢測限度,因此其時(shí)間更短,通量更高。
Single B cell screening methodologies
根據(jù)篩選方式的不同,單個(gè)B細(xì)胞篩選技術(shù)可以分為兩大類:1)開放式的篩選方式,如Beacon,微流控室,微型雕刻系統(tǒng)和毛細(xì)管陣列;2)封閉式的篩選方法,這類篩選都是基于油包水的油珠,將B細(xì)胞和檢測實(shí)際封閉在一個(gè)絕對封閉的環(huán)境中(下圖)
Beacon技術(shù)將數(shù)千個(gè)單個(gè)ASCs或激活的記憶B細(xì)胞放置在定制的培養(yǎng)芯片上的NanoPen室(體積從740pl到1.7nl不等)。在此過程中,它們會在上清液中分泌抗體。為了檢測抗原特異性抗體,包有抗原的微球被放置在NanoPen的正上方,周圍有熒光標(biāo)記的二級抗體。NanoPen室里,分泌的抗體與涂有抗原的微球結(jié)合,并被含有熒光二抗檢測。篩選階段通常只需要幾分鐘到幾小時(shí),然后使用一種稱為光電子定位(OEP)的結(jié)構(gòu)化光系統(tǒng)進(jìn)行特定的單體B細(xì)胞檢索。
微流控室的篩選方法依賴于一個(gè)微型雕刻的聚二甲基硅氧烷(PDMS)支架。包被相關(guān)抗原的微球被加入到含有單個(gè)B細(xì)胞的微室內(nèi),B細(xì)胞分泌的抗體與抗原結(jié)合,并被標(biāo)記的熒光二抗結(jié)合,并通過熒光二抗定位目標(biāo)抗體的B細(xì)胞。
另一種小型化技術(shù)包括一個(gè)微刻系統(tǒng),在該系統(tǒng)中,0.1-1.0 nl體積的微室被印在PDMS芯片上,ASC通過有限稀釋法被分離到這些微室中。為了識別分泌目標(biāo)抗體的單個(gè)ASCs,該系統(tǒng)使用一個(gè)預(yù)涂有抗原的PDMS/玻璃芯片,由分泌的抗體 "打印 "出來,然后用熒光標(biāo)記的二抗檢測分泌的抗體?;蛘呤菍⒍拱辉赑DMS/玻璃芯片上,然后利用熒光標(biāo)記的抗原檢測目標(biāo)抗體,對于陽性的B細(xì)胞,其對應(yīng)的芯片上會形成圓形的熒光信號。在這兩種情況下,都需要一個(gè)特殊的微操縱器來獲取目標(biāo)B細(xì)胞。
與前面提到的方法相比,毛細(xì)管陣列可以檢測更高的通量,其通過將各種40μm的玻璃纖維組合在一起,而不是在PDMS芯片上印刷或雕刻這種方法可以篩選出數(shù)百萬個(gè)體B細(xì)胞。與之前的方法一樣,對于分泌有目的抗體的檢測是通過可移動的包被抗原的芯片進(jìn)行。隨后的單個(gè)目標(biāo)ASC通過毛細(xì)管中的氮?dú)膺M(jìn)行分離。
在全封閉的檢測中,有一種基于微流控技術(shù)的系統(tǒng),其中的水滴被嵌入油基介質(zhì)中,形成油包水乳劑。這些不同的微流控系統(tǒng)的技術(shù)原理與微流控室系統(tǒng)相類似,因?yàn)樗鼈円惨蕾囉趩我豢乖禺愋訟SC分泌的抗體和一個(gè)包被抗原的微球,以及一個(gè)捕獲抗體的熒光二抗。這方面的一個(gè)例外Sphere Fluidics的Cyto-Mine技術(shù),該技術(shù)通過共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)信號來分析鑒定分泌目標(biāo)抗體的單個(gè)ASC。該信號由一個(gè)用供體標(biāo)記的可溶性抗原和一個(gè)用受體探針標(biāo)記的抗IgG二抗,這樣抗原和二抗結(jié)合同一個(gè)抗體后形成能量共振轉(zhuǎn)移,并被檢測。
B cell replica methodologie
B細(xì)胞“復(fù)制”方法顛覆了傳統(tǒng)的篩選方法:目標(biāo)B細(xì)胞的篩選首先提取RNA并進(jìn)行VH-VL目的片段的逆轉(zhuǎn)錄,獲得目的序列后,將目的序列導(dǎo)入到細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。B細(xì)胞“復(fù)制”方法技術(shù)路線如下圖所示,首先分離單個(gè)B細(xì)胞,然后裂解B細(xì)胞并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄構(gòu)建自然配對的VH-VL庫,為了方便后續(xù)的展示,VH-VL在構(gòu)建過程中加入了linker,構(gòu)建完成的VH-VL被導(dǎo)入到完整的細(xì)胞,如哺乳動物細(xì)胞,酵母細(xì)胞或者噬菌體中進(jìn)行展示篩選。該方法已經(jīng)被成功的用于流感病毒特異性抗體的篩選。
Single B cell repertoire analysis and clonal expansion-guided identification
一種相當(dāng)新穎的識別抗原特異性B細(xì)胞的方法是利用最近開發(fā)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù),如10xChromium或任何系統(tǒng)或任何使用攜帶條形碼的珠子的系統(tǒng),如Drop-Seq。這一概念是基于這樣一個(gè)事實(shí):在免疫或感染后,在所有擴(kuò)增的克隆(自然配對的VH-VL獨(dú)特的同源組合)中,抗原特異性B細(xì)胞的流行率高。使用傳統(tǒng)的批量Ig NGS技術(shù)將無法直接傳遞本地抗原特異性單克隆抗體的遺傳信息,因?yàn)檫@些技術(shù)無法檢索到天然配對的單個(gè)VH-VL序列。雖然傳統(tǒng)的批量Ig NGS技術(shù)有一定的缺陷,但是有研究者使用B細(xì)胞測序數(shù)據(jù)(不是天然配對的VH-VL序列),通過分析克隆擴(kuò)增、高頻克隆和突變負(fù)荷等特性,已經(jīng)證明免疫或感染后,抗原特異性克隆會擴(kuò)增并進(jìn)行高頻突變。這一概念進(jìn)一步發(fā)展,并且有研究者根據(jù)這一概念首次篩選了針對埃博拉病毒的單克隆抗體盤。該抗體盤的建立是通過對免疫埃博拉病毒VLP的BALB/c小鼠中的擴(kuò)增頻率最高的克隆進(jìn)行分析,并利用PDMS芯片分選技術(shù)對B細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄獲得天然配對的VH-VL序列。最終選取擴(kuò)增最多的VH-VL序列,然后進(jìn)行合成,克隆到合適的哺乳動物表達(dá)載體中,并以重組形式表達(dá),以證實(shí)其抗原特異性。
總結(jié)
雖然B細(xì)胞分選技術(shù)已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)步,但是基于雜交瘤的分選技術(shù)目前還是主流,這主要是該技術(shù)簡單,方便,而且成本較低,不需要昂貴的儀器。相比較而言,新型的技術(shù)大多需要特定的儀器,而且技術(shù)比較難以掌握,成本高昂。但是,新技術(shù)是發(fā)展使過去一些比較難以篩選的抗體成為可能,如針對GPCR,離子通道,胞內(nèi)抗原的抗體的篩選。另外,過去的幾年,AI技術(shù)在蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測方面取得了巨大進(jìn)步,其在抗體,抗原相互作用預(yù)測方面將有較大的幫助,并且可能更好的指導(dǎo)抗體的改造,但是在抗體發(fā)現(xiàn)方面,單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)還是主要的手段。
參考文獻(xiàn)
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