自FDA 1986年批準(zhǔn)第一個(gè)單克隆抗體以來，目前已經(jīng)有超過100多個(gè)抗體被批準(zhǔn)上市，用于治療病毒感染，腫瘤，自身免疫疾病，代謝性疾病，神經(jīng)疾病和器官移植等疾病，特別是在腫瘤治療領(lǐng)域，目前已經(jīng)有多種類型的抗體如scFvs，ADC，雙特異抗體等。從抗體發(fā)現(xiàn)方面來看，這些已經(jīng)批準(zhǔn)的抗體主要來源于以下幾種技術(shù)：雜交瘤，噬菌體展示，酵母展示，人源化小鼠，單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)，但究其本質(zhì)，基本上所有抗體最終都是來自于B細(xì)胞（除了一些合成庫），因此如何高效的獲取特異性B細(xì)胞一直以來是抗體發(fā)現(xiàn)前進(jìn)的方向。近日 Cell上發(fā)表了一篇名為Single B cell technologies for monoclonal antibody discovery綜述對單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行了匯總。

文章基于B細(xì)胞的培養(yǎng)方式將這些技術(shù)分為兩大類，共6種：1）傳統(tǒng)的基于孔板（96或者384）或者玻片等大體積培養(yǎng)的技術(shù)，如雜交瘤，記憶B細(xì)胞或者ASC（antibody-secreting cells）培養(yǎng)技術(shù)及基于BCR的抗原染色技術(shù)；2）在微小體積中培養(yǎng)的技術(shù)，如Single B cell screening methodologies，B cell replica methodologies，Single B cell repertoire analysis and clonal expansion-guided identification。

下表匯總了6種技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，傳統(tǒng)的雜交瘤在費(fèi)用，親和力等方面具有一定優(yōu)勢，但是在耗時(shí)，通量及特殊抗體（一些特殊表位的抗體）方面有一定的難度；而一些比較成熟的B細(xì)胞分選技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，這里不再詳細(xì)介紹。

B細(xì)胞在體外存活時(shí)間較短，因此為鑒別分泌特定抗體的B細(xì)胞帶來了挑戰(zhàn)。為了延長B細(xì)胞的存活時(shí)間，研究者們開發(fā)了B細(xì)胞永生化技術(shù)，如將B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合或者用EBV病毒感染B細(xì)胞。

雜交瘤技術(shù)是我們熟知的一種B細(xì)胞永生化技術(shù)，它將能夠分泌抗體的B細(xì)胞ASCs與骨髓瘤細(xì)胞融合，使得ASCs能夠獲得瘤細(xì)胞無限繁殖的優(yōu)勢，并且在生長過程中將抗體分泌于培養(yǎng)傷情以供檢測篩選。最初的雜交瘤是小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤融合，但是后來有研究者相繼開發(fā)了骨髓，淋巴結(jié)和PBMC等組織細(xì)胞的融合技術(shù)，并且該技術(shù)也被推廣到了不同種屬如兔子等雜交瘤的制備。融合后利用HAT（次黃嘌呤，氨基碟呤和胸腺嘧啶）培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，排除沒有融合的B細(xì)胞或者骨髓瘤細(xì)胞。為了防止陽性克隆的丟失，一般在融合后的1-2周進(jìn)行抗體特異性檢測，并進(jìn)行亞克隆形成單克隆。

雜交瘤的缺點(diǎn)是，融合的效率相對較低，因此融合后會丟失很多特異性B細(xì)胞。另外，陰性B細(xì)胞形成的雜交瘤會與陽性雜交瘤競爭，可能會導(dǎo)致陽性雜交瘤的丟失。

得益于過去20年B細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，使得記憶型B細(xì)胞不必進(jìn)行永生化也可以在化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中生長。通過特定方法將B細(xì)胞分選到96或者384孔板進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)后既可以進(jìn)行ELISA篩選也可以進(jìn)行功能性篩選，如中和試驗(yàn)等。該方法可以篩選到一些特殊功能的抗體，如廣譜中和抗體。HIV，SARS-CoV-1的一些廣譜中和抗體就是通過該方法篩選的。

另外，基于該培養(yǎng)方式，還可以通過半固體培養(yǎng)基，利用抗原包被磁珠，搭配熒光標(biāo)記的二抗，篩選能夠分泌目標(biāo)抗體的B細(xì)胞，該方法因?yàn)槔冒牍腆w培養(yǎng)基，因此無需物理上對B細(xì)胞進(jìn)行分離，其篩選基數(shù)會更大。

該篩選方法是基于記憶型B細(xì)胞表面的抗體（BCR），其主要是對抗原進(jìn)行標(biāo)記，如熒光標(biāo)記，磁珠標(biāo)記或者是核酸標(biāo)記，然后利用這些標(biāo)記的抗原對目標(biāo)B細(xì)胞進(jìn)行分離，如通過熒光進(jìn)行FACS篩選。該方法在篩選中容易產(chǎn)生假陽性，因此實(shí)際篩選中經(jīng)常對抗原進(jìn)行不同的標(biāo)記，如雙熒光或者不同的Tag標(biāo)簽等，進(jìn)行交叉篩選排除非特異性結(jié)合的B細(xì)胞。

該技術(shù)是目前比較流行的篩選方法，因?yàn)槠渚哂休^高的通量，較低的成本并且簡便易操作。但是由于該方法是基于BCR篩選，因此只能篩選記憶型B細(xì)胞，而沒有BCR的一些B細(xì)胞無法被篩選到。

以上介紹的篩選技術(shù)都是基于常規(guī)的孔板或者微型玻片技術(shù)，但是隨著技術(shù)的更新和進(jìn)步，目前出現(xiàn)了多種基于微流控的篩選技術(shù)，該技術(shù)使得單個(gè)B細(xì)胞可以在很小體積中培養(yǎng)，使得抗體的濃度很快達(dá)到檢測限度，因此其時(shí)間更短，通量更高。

根據(jù)篩選方式的不同，單個(gè)B細(xì)胞篩選技術(shù)可以分為兩大類：1）開放式的篩選方式，如Beacon，微流控室，微型雕刻系統(tǒng)和毛細(xì)管陣列；2）封閉式的篩選方法，這類篩選都是基于油包水的油珠，將B細(xì)胞和檢測實(shí)際封閉在一個(gè)絕對封閉的環(huán)境中（下圖）

Beacon技術(shù)將數(shù)千個(gè)單個(gè)ASCs或激活的記憶B細(xì)胞放置在定制的培養(yǎng)芯片上的NanoPen室（體積從740pl到1.7nl不等）。在此過程中，它們會在上清液中分泌抗體。為了檢測抗原特異性抗體，包有抗原的微球被放置在NanoPen的正上方，周圍有熒光標(biāo)記的二級抗體。NanoPen室里，分泌的抗體與涂有抗原的微球結(jié)合，并被含有熒光二抗檢測。篩選階段通常只需要幾分鐘到幾小時(shí)，然后使用一種稱為光電子定位（OEP）的結(jié)構(gòu)化光系統(tǒng)進(jìn)行特定的單體B細(xì)胞檢索。

微流控室的篩選方法依賴于一個(gè)微型雕刻的聚二甲基硅氧烷（PDMS）支架。包被相關(guān)抗原的微球被加入到含有單個(gè)B細(xì)胞的微室內(nèi)，B細(xì)胞分泌的抗體與抗原結(jié)合，并被標(biāo)記的熒光二抗結(jié)合，并通過熒光二抗定位目標(biāo)抗體的B細(xì)胞。

另一種小型化技術(shù)包括一個(gè)微刻系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中，0.1-1.0 nl體積的微室被印在PDMS芯片上，ASC通過有限稀釋法被分離到這些微室中。為了識別分泌目標(biāo)抗體的單個(gè)ASCs，該系統(tǒng)使用一個(gè)預(yù)涂有抗原的PDMS/玻璃芯片，由分泌的抗體 "打印 "出來，然后用熒光標(biāo)記的二抗檢測分泌的抗體?；蛘呤菍⒍拱辉赑DMS/玻璃芯片上，然后利用熒光標(biāo)記的抗原檢測目標(biāo)抗體，對于陽性的B細(xì)胞，其對應(yīng)的芯片上會形成圓形的熒光信號。在這兩種情況下，都需要一個(gè)特殊的微操縱器來獲取目標(biāo)B細(xì)胞。

與前面提到的方法相比，毛細(xì)管陣列可以檢測更高的通量，其通過將各種40μm的玻璃纖維組合在一起，而不是在PDMS芯片上印刷或雕刻這種方法可以篩選出數(shù)百萬個(gè)體B細(xì)胞。與之前的方法一樣，對于分泌有目的抗體的檢測是通過可移動的包被抗原的芯片進(jìn)行。隨后的單個(gè)目標(biāo)ASC通過毛細(xì)管中的氮?dú)膺M(jìn)行分離。

在全封閉的檢測中，有一種基于微流控技術(shù)的系統(tǒng)，其中的水滴被嵌入油基介質(zhì)中，形成油包水乳劑。這些不同的微流控系統(tǒng)的技術(shù)原理與微流控室系統(tǒng)相類似，因?yàn)樗鼈円惨蕾囉趩我豢乖禺愋訟SC分泌的抗體和一個(gè)包被抗原的微球，以及一個(gè)捕獲抗體的熒光二抗。這方面的一個(gè)例外Sphere Fluidics的Cyto-Mine技術(shù)，該技術(shù)通過共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）信號來分析鑒定分泌目標(biāo)抗體的單個(gè)ASC。該信號由一個(gè)用供體標(biāo)記的可溶性抗原和一個(gè)用受體探針標(biāo)記的抗IgG二抗，這樣抗原和二抗結(jié)合同一個(gè)抗體后形成能量共振轉(zhuǎn)移，并被檢測。

B細(xì)胞“復(fù)制”方法顛覆了傳統(tǒng)的篩選方法：目標(biāo)B細(xì)胞的篩選首先提取RNA并進(jìn)行VH-VL目的片段的逆轉(zhuǎn)錄，獲得目的序列后，將目的序列導(dǎo)入到細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。B細(xì)胞“復(fù)制”方法技術(shù)路線如下圖所示，首先分離單個(gè)B細(xì)胞，然后裂解B細(xì)胞并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄構(gòu)建自然配對的VH-VL庫，為了方便后續(xù)的展示，VH-VL在構(gòu)建過程中加入了linker，構(gòu)建完成的VH-VL被導(dǎo)入到完整的細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞，酵母細(xì)胞或者噬菌體中進(jìn)行展示篩選。該方法已經(jīng)被成功的用于流感病毒特異性抗體的篩選。

Single B cell repertoire analysis and clonal expansion-guided identification

一種相當(dāng)新穎的識別抗原特異性B細(xì)胞的方法是利用最近開發(fā)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，如10xChromium或任何系統(tǒng)或任何使用攜帶條形碼的珠子的系統(tǒng)，如Drop-Seq。這一概念是基于這樣一個(gè)事實(shí)：在免疫或感染后，在所有擴(kuò)增的克隆（自然配對的VH-VL獨(dú)特的同源組合）中，抗原特異性B細(xì)胞的流行率高。使用傳統(tǒng)的批量Ig NGS技術(shù)將無法直接傳遞本地抗原特異性單克隆抗體的遺傳信息，因?yàn)檫@些技術(shù)無法檢索到天然配對的單個(gè)VH-VL序列。雖然傳統(tǒng)的批量Ig NGS技術(shù)有一定的缺陷，但是有研究者使用B細(xì)胞測序數(shù)據(jù)（不是天然配對的VH-VL序列），通過分析克隆擴(kuò)增、高頻克隆和突變負(fù)荷等特性，已經(jīng)證明免疫或感染后，抗原特異性克隆會擴(kuò)增并進(jìn)行高頻突變。這一概念進(jìn)一步發(fā)展，并且有研究者根據(jù)這一概念首次篩選了針對埃博拉病毒的單克隆抗體盤。該抗體盤的建立是通過對免疫埃博拉病毒VLP的BALB/c小鼠中的擴(kuò)增頻率最高的克隆進(jìn)行分析，并利用PDMS芯片分選技術(shù)對B細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄獲得天然配對的VH-VL序列。最終選取擴(kuò)增最多的VH-VL序列，然后進(jìn)行合成，克隆到合適的哺乳動物表達(dá)載體中，并以重組形式表達(dá)，以證實(shí)其抗原特異性。

雖然B細(xì)胞分選技術(shù)已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)步，但是基于雜交瘤的分選技術(shù)目前還是主流，這主要是該技術(shù)簡單，方便，而且成本較低，不需要昂貴的儀器。相比較而言，新型的技術(shù)大多需要特定的儀器，而且技術(shù)比較難以掌握，成本高昂。但是，新技術(shù)是發(fā)展使過去一些比較難以篩選的抗體成為可能，如針對GPCR，離子通道，胞內(nèi)抗原的抗體的篩選。另外，過去的幾年，AI技術(shù)在蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測方面取得了巨大進(jìn)步，其在抗體，抗原相互作用預(yù)測方面將有較大的幫助，并且可能更好的指導(dǎo)抗體的改造，但是在抗體發(fā)現(xiàn)方面，單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)還是主要的手段。

參考文獻(xiàn)

Alessandro Pedrioli and Annette Oxenius.Single B cell technologies for monoclonal antibody discovery. Trends in Immunology 2021